【摘要】
为了确定麝珠明目滴眼液是否适用于结膜炎、角膜炎的治疗，进行了该药的抑菌试验、抗病毒试验以及对结膜炎，角膜炎动物模型的抗炎试验。结果表明：（1）在终浓度0.5～2mg/ml时，麝珠明目滴眼液对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌有较强的抑菌作用，而对铜绿假单孢菌及致病性大肠杆菌的抑制作用较弱。（2）在细胞培养抗病毒试验中，麝珠明目滴眼液对单纯疱疹病毒II型的IC50为20.1±3.9μg/ml，MIC62.5μg/ml，治疗指数是77.5；对7型腺病毒IC50 25.8±4.0μg/ml，MIC 62.5μg/ml，治疗指数72.6，表明该药对眼科常见致病性病毒有较显著对抗作用；（3）对二甲苯刺激诱发结膜炎动物模型以及局部注射金黄色葡萄球菌引起的角膜炎模型，麝珠明目滴眼液均有显著的抗炎作用，6%麝珠明目滴眼液的疗效与单纯模型组比较P值均小于0.01。综上所述，麝珠明目滴眼液扩大临床适应症，用于治疗结膜炎和角膜炎是合理的。
一. 试验目的
通过体外抑菌、抗病毒试验以及动物模型系列试验观察麝珠明目滴眼液对结膜炎、角膜炎的治疗作用，为该药的临床扩大适应症提供依据。
二. 受试药品
麝珠明目滴眼液，每份含麝珠明目散0.3g/支,和溶剂5ml/支，由福建麝珠明眼药股份有限公司生产（卫药准字Z-116号），批号00803及930817号。
三. 实验动物及菌株
ICR系小鼠，清洁级，购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司，0153号；大耳白兔，由福建医科大学实验动物中心供应。金黄色葡萄球菌ATCC2913，乙型溶血性链球菌32210，致病性大肠杆菌EPEC0126，引自卫生部北京药品生物制品检定所，铜绿假单孢菌ATCC27853，金黄色葡萄球菌ATCC25923 ,由本校临床微生物教研室提供。单纯疱疹病毒II型（HSV-II）及7型腺病毒均由中国预防医学科学院病毒研究供应。
四. 试验方法和结果
（一） 抑菌试验：采用试管稀释法[1]测定麝珠明目滴眼液对金黄色葡萄球菌ATCC2913，ATCC25923，乙型溶血性链球菌32210，致病性大肠杆菌EPEC0126以及铜绿假单孢菌ATCC27853的直接抑制作用，阳性对照药选用硫酸庆大霉素注射液。试验用麝珠明目散经溶剂及肉汤稀释后除菌滤膜减压过滤后使用。药物终浓度从0.49～2000μg/ml，共13个浓度梯度，与细菌在35℃共孵24小时后观察结果并以最低抑菌浓度（MIC）表达之，详见表1。
表1.麝珠明目滴眼液体外抑菌作用
菌　 种 MIC
庆大霉素 麝珠明目滴眼液
金黄色葡萄球菌ATCC2913 0.25μg/ml 2mg/ml
金黄色葡萄球菌ATCC25923 0.25 μg/ml 0.5 mg/ml
乙型溶血性链球菌32210 0.25μg/ml 1 mg/ml
大肠杆菌EPEC0126 0.25 μg/ml 2 mg/ml以上
铜绿假单孢菌ATCC27853 2μg/ml 2 mg/ml以上
抑菌试验结果提示，麝珠明目滴眼液对眼科常见致病菌金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌有一定的直接抑制作用，对铜绿假单孢菌及大肠杆菌EPEC0126等的敏感性较低。另外，由于该药部分成份溶解度差，经除菌过滤后这些成份多除去，可能对抑菌作用有一定影响，剂量计算也不够准确。
（二）抗病毒作用：
甲. 预备试验：
1.在非洲绿猴肾（VERO）和人肺癌传代细胞（A549）细胞培养内测定药物的半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。
①细胞形态变化（CPE）法：于96孔培养板接种40万细胞/ml细胞悬液100μl/孔，37℃，5%CO2培养24小时后，分别加入已稀释好的麝珠明目滴眼液2000μg/ml～15.6μg/ml，和阳性对照药利巴韦林4000μg/ml～31.25μg/ml，每个浓度4孔，每孔100μg，同时，设正常细胞对照组，再置37℃，5% CO2继续培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞破坏情况：25%以下记+，26～50%记＋＋，51～75%破坏记＋＋＋，76～100%破坏者记＋＋＋＋，用Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度（TD50）和最大无毒浓度（TD0）。
②细胞MTT染色法：观察药物对VERO和A549细胞的毒性CPE结果后，每孔加入MTT染液10μl，置37℃，5%CO2培养4小时，可见细胞内形成甲赘结晶，弃染色液，加入10%二甲基甲酰胺裂解液（SDS）100μl，再置37℃，5% CO2培养，直至甲赘全部溶出（约6～20小时）后，用酶标仪测OD570，记录OD值，计算TD50和TD0。
2.在VERO和A549细胞培养内测定单纯疱疹病毒II型和7型腺病毒的半数感染滴度（TCID50）
①单纯疱疹病毒II型（HSV-II）：于96孔培养板内接种VERO细胞（40万/ml）悬液100μl/孔，置37℃，5% CO2培养24小时，HSV-II以10倍连续稀释10-1～10-11加入细胞中，培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录破坏情况：25%以下破坏记+，26～50%破坏记++，51～75%破坏记+++，76～100%破坏记++++，用Reed-Muench法计算病毒半数感染滴数（TCID50）。
②7型腺病毒（Ad7）：于96孔培养板内接种A549细胞（40万/ml）悬液100μl/孔，置37℃，5% CO2培养24小时，Ad7 10倍连续10倍稀释10-1～10-6，加于细胞中，继续培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞破坏情况，用Reed-Muench法计算该病毒TCID50。
3.预备试验结果
①药物对细胞的毒性作用：三次试验结果见表2.和表3.：
表2.麝珠明目滴眼液对VERO细胞的毒性测定结果（3批）
药　物 试验方法 TD0(μg/ml) TD50 (μg/ml)
麝珠明目滴眼液 CPE法 1000±0 1441±47.9
MTT法 1000±0 1518.6±4.5
利巴韦林 CPE法 ＞4000±0 ＞4000±0
MTT法 ＞4000±0 ＞4000±0
表3.麝珠明目滴眼液对A细胞的毒性测定结果（3批）
药　物 试验方法 TD0(μg/ml) TD50 (μg/ml)
麝珠明目滴眼液 CPE法 1000±0 1500±70
MTT法 1000±0 1844.5±36
利巴韦林 CPE法 ＞4000±0 ＞4000±0
MTT法 ＞4000±0 ＞4000±0
②单纯疱疹病毒HSV-II和7型腺病毒Ad7对VERO细胞和A549的半数感染量TCID50分别是10-7和10-4。
乙.正式试验：采用病毒细胞病变（CPE）法和噻唑兰（MTT）法测定麝珠明目滴眼液和阳性对照药利巴韦林的半数有效浓度（IC50）和最小有效浓度（MIC），计算治疗指数（TI）。试验分一次给药组和3次给药组并重复3遍。
1.一次给药组
①病毒CPE法：VERO和A549细胞1：3传代，以40万/ml细胞浓度接种于96孔培养板，每孔100μl，置37℃，5% CO2温箱培养24小时，分别加入单纯疱疹II型病毒10～100TCID50，每孔100μl，置37℃，吸附1小时后弃掉病毒液。7型腺病毒以10～100TCID50，每孔加100μl，置37℃吸附1小时后弃掉病毒液，然后加入药物。麝珠明目滴眼液和阳性对照药利巴韦林均选用最大无毒浓度1000～7.8μg/ml，二倍稀释8个浓度，每浓度4孔，每孔加100μl，同时设病毒对照和细胞对照组，置37℃，5% CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜观察细胞形态变化，直至病毒导致对照细胞出现＋＋＋和＋＋＋＋病变，用Reed-Muench法计算药物IC50和MIC，以及TI。
②病毒MTT法：观察细胞病变CPE结束后，加入MTT染液，每孔100μl，置37℃，5% CO2培养4小时，可见到细胞内形成甲赘结晶，弃掉染色液，加入10%二甲基甲酰胺裂解液（SDS）100μl，置37℃，5% CO2培养6～20小时，待甲赘全部溶出后，于酶标仪测OD570，记录OD值，计算IC50和MIC，以及TI。
2.三次给药组：方法同一次给药组，每24小时将旧药液弃掉，重新加入同浓度药液，病毒对照和细胞对照换维持液。连续3天，试验重复三次。
3.试验结果：见表4.和表5.
表4.麝珠明目滴眼液抗单纯疱疹病毒II型作用
药　物 方法 一次给药 三次给药
IC50(μg/ml) MIC(μg/ml) TI IC50(μg/ml) MIC(μg/ml) TI
麝珠明目滴眼液 CPE法 22.7±2.8 62.5±0 64 36.0±15.0 104.1±36.0 46.9
MTT法 20.1±3.9 62.5±0 77.5 40.5±14.5 104.1±36.0 41.9
利巴韦林 CPE法 21.0±0.9 62.5±0 ＞190.2 25.2±1.2 62.5±0 ＞159.2
MTT法 20.8±5.3 62.5±0 ＞201 21.5±6.7 62.5±0 201.5
表5.麝珠明目滴眼液抗7型腺病毒作用
药　物 方法 一次给药 三次给药
IC50(μg/ml) MIC(μg/ml) TI IC50(μg/ml) MIC(μg/ml) TI
麝珠明目滴眼液 CPE法 22.7±6.0　 62.5±0 55.6 23.9±4.2 　62.5±0 64.9
MTT法 25.8±4.0 62.5±0 72.6 26.6±1.8 62.5±0 　69.6
利巴韦林 CPE法 19.9±7.4 41.6±18.0 ＞217 10.9±4.0 31.25±0 ＞395
MTT法 13.4±0.5 41.6±18.0 298.1 12.6±0.8 31.25±0 ＞317
上述结果提示，无论是一次给药或者三次给药，麝珠明目滴眼液对单纯疱疹病毒II型和7型腺病毒均有较明显的抑制作用，且CPE法测定结果与MTT法的结果相近。另外，三次给药组的疗效并不比一次给药组的疗效更好，尤其是对单纯疱疹病毒II型的抑制。
(三)抗结膜炎：大耳白兔30只，雄性，体重2.3～3.0kg。首先，给每兔右眼结膜囊，滴入8%二甲苯1滴，并闭眼30秒钟，放开后取注射用生理盐水冲洗3遍。然后随机分为5组，每组6只。取其中3组白兔分别给予3.0，6.0以及9.0%麝珠明目滴眼液滴眼，1组滴0.25%氯霉素，做为阳性对照组，另1组为单纯模型组，以注射用生理盐水代替药物滴眼。以上均每日滴眼3次，连续滴2日，并于滴入致炎剂二甲苯后48小时，以左眼为对照判断右眼的发炎程度及药物疗效，结果进行H检验，详见表6.。发炎程度判断如下：0级结膜囊无充血水肿，无分泌物增多现象，角膜透明清晰，无水肿，混浊；I级：结膜轻度水肿和充血，但角膜透明清晰；II级：结膜中度红肿，角膜轻度水肿；III级：结膜明显红肿，伴角膜水肿，眼睛分泌物明显增多；IV级：结膜囊严重红肿，分泌物外溢或伴脓性分泌物，角膜水肿、混浊。
表6.麝珠明目滴眼液对二甲苯刺激性眼结、角膜损伤的影响
组别 药　物 眼炎例数
0级 I级 II级 III级 IV级 合计 P值
1 生理盐水 0 0 0 0 6 6
2 0.25%氯霉素 0 1 2 1 2 6 ＜0.05
3 3%麝珠明目液 0 0 1 1 4 6 ＞0.05
4 6%麝珠明目液 0 1 2 2 1 6 ＜0.01
5 9%麝珠明目液 0 1 2 2 1 6 ＜0.01

从表6可见，对二甲苯刺激诱发的眼结膜和角膜损伤，麝珠明目滴眼液有良好的治疗作用，其中6和9%浓度均有显著疗效与单纯模型组比较，P值均小于0.01。
（四）抗细菌性角膜炎[2]：取大耳白兔30只，1%地卡因滴右眼，表面麻醉后，自角膜中心旁1mm处向角膜实质层注入0.05ml金黄色葡萄球菌液（3×108/ml），形成直径4mm的乳白色水泡，染菌后24小时进行随机分组，按表7所示给药，每次每眼0.2ml，每日2次，连续11日，末次药后24小时，用眼科角膜显微镜确定角膜病变程度，具体分级如下：0级：角膜实质层透明清晰，薄；I级：角膜轻度水肿，虹膜清晰；II级：角膜水肿，混浊，但是,虹膜纹理仍可窥见；III级：角膜明显混浊,但是可见到瞳孔,可有少量散在的漂浮状脓液;IV级：角膜严重混浊，前房结构无法窥见,可有前房积液及角膜层间质脓。观察及评级时以左眼为对照,结果采用H检验,详见表7.
表7.麝珠明目滴眼液对家兔细菌性角膜炎的影响
组别 药　物 眼炎例数
0级 I级 II级 III级 IV级 合计 P值
1 生理盐水 0 0 0 0 6 6
2 0.25%氯霉素 0 2 1 2 1 6 ＜0.01
3 1.5%麝珠明目液 0 0 1 1 4 6 ＞0.05
4 3%麝珠明目液 0 1 2 1 2 6 ＞0.05
5 6%麝珠明目液 0 1 2 2 1 6 ＜0.01
试验结果表明,3%和6%麝珠明目滴眼液对金黄色葡萄球菌性角膜炎有比较显著的抑制作用。其中,临床应用的6%麝珠明目液的抑制作用尤其显著,与单纯模型组比较,P值＜0.01,差异有非常显著意义。
五.结论
1.在抑菌试验中,终浓度0.5～2mg/ml麝珠明目滴眼液对眼科常见致病菌金黄色葡萄球菌,乙型溶血性链球菌等有较强的抑菌作用，对铜绿假单孢菌及致病性大肠杆菌的抑制作用较弱些。
2.在细胞培养试验中，麝珠明目滴眼液对单纯疱疹病毒II型和7型腺病毒均有较显著的抑制作用。根据MTT法试验结果,对单纯疱疹病毒II型IC50是20.1±3.9μg/ml，MIC 62.5μg/ml，治疗指数为77.5。对7型腺病毒则分别是IC50是25.8±4.0，MIC 62.5，治疗指数72.6。
3.无论是对二甲苯局部刺激诱发的结膜炎或者角膜注射金黄色葡萄球菌引起的角膜炎，6%麝珠明目滴眼液都有显著的抗炎症作用，与单纯模型组比较P值均小于0.01,差异在统计学上有非常显著意义。
综上所述，麝珠明目滴眼液扩大临床适应症用于治疗结膜炎和角膜炎是合理的。
主要参考文献:
1. 李影林,等。临床微生物学及检验。P593,吉林科学出版社,1991.
2. 鲍玉洲,等。家兔细菌性角膜炎动物模型的建立。眼科研究,1991;9(2):71